CAMARA DE NEUBAUER

Recuento de eritrocitos: ejemplo
Observe que en la grilla de la cámara de Neubauer las áreas de recuento de eritrocitos y linfocitos son diferentes. Los glóbulos rojos se cuentan en las áreas coloreadas de rojo, mientras que los glóbulos blancos se cuentan en las áreas coloreadas de azul. Ten en cuenta que la grilla central tiene 25 cuadrados de 1mm x 1mm de área y 0.10 mm de profundidad. El factor de dilución es por tanto de 1:200. Convierte el número de glóbulos rojos contados en 5 cuadrados a nº glóbulos rojos/µl. (1 µl (microlitro) = 1 mm3 )
Como se hace?

La imagen de abajo simula el campo que esta viendo al microscopio con un objetivo de 45x. Solo es visible el centro de la grilla. Intenta verificar esto al ir moviendo el campo de derecha-izquierda y de arriba-abajo, como si de una pletina de microscopio se tratase. Cuenta los glóbulos rojos en los cinco cuadrados mencionados anteriormente y determina el recuento de eritrocitos como se ha descrito anteriormente..
Muy importante: Cuando un eritrocito se sitúa en mitad de las líneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado. Pero no se contabiliza cuando se sitúa en mitad de las líneas inferior y/o de la derecha..
El rango normal de recuento de glóbulos rojos es el siguiente:
Mujeres:
3.9-5.6 millones/µl
Hombres:
4.5-6.5 millones/µl
Determine el recuento del sujeto cuya muestra aparece en la imagen.
Cual es la solución?







Técnicas de estudio de líneas celulares
TÉCNICAS DE CONTAJE
CELULAR
Una suspensión celular se caracteriza por
presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido.
Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en
la suspensión como el porcentaje de éstas que son viables.
Para determinar la densidad de las células se
emplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje
celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos
(cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular como el
"Cell Coulter" de la empresa








El principio del contador celular se basa en la
medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando
una partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un
pequeño orificio. Como se puede ver en el esquema, una pequeña abertura entre
los electrodos es la zona sensible a través de la que pasan las partículas
que se encuentran en suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificio
desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido
como un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al
volumen de la partícula. controlando la cantidad de la suspensión que
circula a través del orificio es posible contar y medir el tamaño de las
partículas. Es posible contar y medir varios miles de partículas por segundo,
independientemente de su forma, color y densidad.



En la unidad de Citometría de flujo y
Microscopia Confocal de los
se dispone de contadores celulares.
Sin
embargo, es
posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos
basta con una cámara de contaje celular, por ej. la cámara de Neubauer, y un
microscopio. Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se
coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unas
señales que determinan un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el
microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se puede
determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen.








La cámara de Neubauer es una cámara de contaje
adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata
de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual
se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve
en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos
lineas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L
corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos
está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre
con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el
volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1
milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.



Si contamos las cuatro áreas sombreada (L)
observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en
la suspensión celular será :
concentración en la suspensión (células / mL) =
10000 (x/4)








En la imagen puedes observar el aspecto de una
de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una
cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta imagen
ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.









Existen numerosos modelos de cámaras de contaje
celular adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen puedes observar una
cámara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prácticas.





Para determinar la viabilidad celular se
emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán.
El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células
que presentan roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen en
la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar
células blancas, por exclusión, a células viables es un error pues por este
método se sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión,
determinando como inviables sólo aquellas con la membrana rota. Existen
otros métodos de determinación de la viabilidad celular como el más preciso
de la tinción con ioduro de
propidio



En la red dispones de descripciones detalladas
sobre como la propuesta por P.J. Hansen, o la detallada descripción que aporta
Beckton-Dickinson
, y los problemas de cálculo de
parámetros celulares que plantea empleando datos obtenidos a partir de un
hemocitómetro, y otros protocolos
para el contaje de células
(en protocol-online)
- arriba -






se aseptiza el dedo con alcohol y luego se seca
al aire o con algodón. Se coge entre el pulgar y el índice y se hace una
punción rápida y penetrante a través de la piel de la punta del dedo con una
lanceta estéril.









2. Se
deshecha la primera gota de sangre y se aspira la siguiente con la pipeta de
dilución perfectamente limpia y seca hasta la señal 1 o 0.5 (también puede
utilizarse la pipeta de hemoglobina, de 20 microlitros). Hay que evitar la
entrada de burbujas de aire, pudiendo ayudarnos de un papel de filtro para
conseguir el enrasado.









3. A
continuación se toma con la pipeta líquido de Hayem, isotónico con la sangre,
hasta la señal 1; así, la sangre queda diluida al 1/10, si tomamos sangre
hasta la señal 1, o al 1/20 si tomamos hasta 0.5. Esto es así porque el
volumen de la bola de la pipeta es 100 veces superior al del capilar de la
misma. (Si hemos utilizado la pipeta de hemoglobina podemos diluir su contenido
en 2 o 4 ml de líquido de Hayem para obtener diluciones 1/100 o 1/200).









4. Tomamos
la pipeta (o el tubo de ensayo) entre los dedos índice y pulgar y agitamos. A
través de la goma de conexión con la pipeta, soplamos para despreciar las
primeras gotas por corresponder al líquido que estaba en el capilar.









5. Se
adapta un cubreobjetos sobre una cámara cuentaglóbulos limpia y seca y se
coloca una gota en uno de los lados del cubre; esta gota penetra por
capilaridad y rellena el retículo de la misma.









6. Una
vez preparada la cámara se coloca sobre la platina del microscopio dejándose
unos minutos en reposo para que sedimenten los glóbulos. Disponemos el
condensador bajo y luz débil; enfocamos primero con el objetivo débil seco y
luego se cambia al fuerte seco para proceder al recuento, que se lleva a cabo
en los cuadrados pequeños del retículo marcado en color rojo. Finalizado
el recuento se procede a la limpieza de la pipeta con acético 1:3, agua
destilada y alcohol-éter sucesivamente.









7.El volumen
de sangre en el cual se han contado las células resulta de multiplicar la
profundidad de la cámara por el factor de dilución, la superficie de los
cuadrados y el número de cuadrados contados.
Con cámara de NEUBAUER:
Superficie de 1 cuadrado grande (1/20 mm de lado):



Volumen de un cuadrado
grande (1/10 mm de profundidad):



Si contamos
"a" glóbulos rojos en "n" cuadrados pequeños, el número
de glóbulos por cuadrado será a/n.
Si en un volumen 1/4000
mm3 hay a/n glóbulos rojos, en 1 mm3 habrá X. Luego:




siendo X el número de
glóbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre diluida.
Si la sangre se
diluyó a 1/100 o 1/200, habrá que multiplicar el valor X por 100 o 200
respectivamente, con lo cual obtendremos un nuevo valor, Y, que representa el
número de glóbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre (sin
diluir).








Se utilizan para calcular, mediante el uso del
microscopio, el número de partículas (leucocitos, hematíes, bacterias…) por
unidad de voluimen de un líquido.
La cámara está constituida por una placa base de
vidrio especial pareciso a un porta, su parte central se encuentra separada de
los extremos por unas ranuras. en ella se encuentran las cuadrículas de
recuento.
La fórmula de contaje es: partículas/mm3=
partículas contadas.
Clases de cámaras:
- Neubauer improved: Es el más utilizado (9
cuadros grandes, cada 1 de 1 mm2.)
- Neubauer: La diferencia es el cuadro grande
central.
- Thoma: Se utiliza solo para el recuento de
eritrocitos.
- Fuchs-Rosenthal: Se utiliza habitualmente para
recuento de células en líquidos orgánicos (LCR, Líquido sinovial…)